复制概况
复制体系
复制的起始、延伸与终止
其他原核生物的复制体系
其他形式的复制
真核生物的复制过程
DNA复制
本讲内容提纲
1 DNA复制的基本机理－半保留复制
2 DNA复制的起点、方向和方式
3 DNA聚合酶和DNA聚合反应
4 复制的基本过程
5 DNA复制的半不连续性
第一组：复制概况
1 、DNA复制的基本机理－半保留复制
半保留复制： DNA在复制时，以亲代DNA的每一条链作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA链。
全保留复制
半保留复制
混合复制
DNA半保留复制的实验依据：
1958年 Meselson & Stahl
E.coli 放射性同位素（15N）标记
CsCl密度梯度离心
培养一代
培养二代
培养三代
亲代
子一代
子二代
轻带
重带
混合带
DNA半保留复制的意义：保证DNA代谢的稳定性。
经过多代的复制，亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，子代DNA仍可以保持与最初亲本的一致性。
稳定性是相对的，变异是绝对的
2 、DNA复制的起点、方向和方式
2.1 DNA复制的起点
原核生物DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点（ori ）。
原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。
复制子(replicon)或复制单元：
DNA分子上一个独立的复制单位，DNA复制从起点开始，进行到终点结束。
一个复制子包括一个复制起点和复制终点。
原核生物单复制起点，整个染色体只有一个复制子
真核生物: 多复制起点，一个genome中有多个复制子。
复制起点具有特征性：
细菌、酵母以及叶绿体、线粒体等的DNA复制起点已经被克隆，其核酸序列的共同特点是富含A-T序列。
2.2 DNA复制的方向：
多数DNA双向复制
单向进行：有些病毒（如腺病毒等）、质粒DNA及线粒体DNA。
复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。
复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛。
复 制 起 点
复 制 叉
亲 代 链
子 代 链
复 制 叉
真核生物DNA分子复制具有多个复制子，多个复制眼
2.3 DNA复制的方式
双向等速复制：大多数生物体内DNA。
不等速复制：如枯草杆菌。
对称复制：大多数生物体内的DNA的两条链同时复制。
不对称复制：在一定时期内DNA只复制一条链的情况。
如线粒体的D-环复制和噬菌体的滚环复制方式。
3 DNA聚合酶和DNA聚合反应
DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。
Poly(核苷酸)n－3’-OH ＋ dNTP → Poly(核苷酸)n+1－3’-OH
＋ 2Pi
4 DNA复制的半不连续性
DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?
冈崎片段的大小：原核生物为1000-2000bp，真核生物100bp。
半不连续复制:
DNA聚合酶
DNA连接酶
螺旋酶
单链结合蛋白
DNA拓扑异构酶
第二组：复制体系
1 DNA聚合酶
DNA的复制是由DNA聚合酶负责完成的，按照模板催化合成新DNA链。
共同性质:
[1] 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为原料;
[2] 需要模板;
[3] 不能起始合成新的DNA链, 需要引物;
[4] 合成方向5‘→3’ 。
DNA聚合酶（DNA polymerase）
1 DNA聚合酶
1.1 大肠杆菌的DNA聚合酶
1.2 DNA聚合酶和复制的忠实性
1.3 其它生物的聚合酶
1.4 DNA聚合酶的引物
1.1 大肠杆菌的DNA聚合酶
DNA聚合酶Ⅰ: 主要参与损伤DNA的修复，同时在半保留复制中有辅助作用，
DNA聚合酶II：主要参与DNA修复，
DNA聚合酶III：DNA合成的主要复制酶。
1.1.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
DNA polymeraseⅠ，DNApolⅠ
1956年，Arthur Kornberg
(1)理化性质：
一条多肽链，103KD。
含一个Zn2+
400个分子/细胞，
37℃催化约1000bp/min,
（2）功能特点
1） 5’ →3’聚合功能
2） 3’ →5’外切活性
3） 5’ →3’外切活性
4） 5’ →3’内切酶活性
切口移位反应
缺口平移标记DNA探针
枯草杆菌蛋白酶处理后，成两个片段，大片段68KD，称为Klenow片段。
1.1.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：

(1) 理化性质：
120KD，
100个酶分子/细胞，
活性只有DNA polⅠ的5%。
（2）功能特点：
5′→3′聚合活性
3′→5′外切活性，
没有5′→3′外切活性
不是复制的主要聚合酶, 与DNA损伤修复有关。
1.1.3 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ (DNApolⅢ)
理化性质：
10-20个酶分子/细胞。
活性是DNA pol I的15倍, pol II300倍。
聚合反应需要ATP的存在。
反应有很高的速度和高度的进行性。
进行性：聚合酶结合于单链模板不解离的能力。
DNApol Ⅲ 全酶有十种共18个亚基
（2）结构组成和功能特点
β
DNA聚合酶Ⅲ含有以下4个不同的功能组分：

1）核心聚合酶: 由α、ε、θ三种亚基组成。
功能：
α亚基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。
ε亚基具有3’ -5’外切核酸酶的校对功能，
θ亚基促进ε亚基的作用。
2）β二聚体

β亚基以二聚体、环状的形式环绕着DNA并在DNA自由滑动，构成一个滑动钳。

功能：滑动钳把全酶束缚在模板DNA上，保证高度的进行性。
3）γ复合物
含有5种亚基：γ2δ1δ’1χ1ψ1。
功能:γ复合物是β滑动钳的载体，帮助β滑动钳结合到DNA上。
γ复合物有依赖DNA的ATP酶活性。
β二聚体自己并不能组装到DNA上，通过γ复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的。
4）τ二聚体
功能：τ2 将两个核心酶分子和一个γ复合物连接起来。
τ亚基是一个依赖于DNA的ATP酶。
表 E.coli 中的三种DNA多聚酶
生物学活性

核苷酸数／min
1000
50
约50,000
0.05
15
1.2 DNA聚合酶和复制的忠实性

复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息准确传递的一个必要条件，它取决于碱基配对的专一性。

DNA聚合酶可以通过以下方式提高互补碱基选择的专一性。
1）碱基配对原则维持DNA复制的准确性：
2） DNA聚合酶本身的校对作用
DNApol的3’5’外切酶活性可切除错配碱基，使得DNA复制错误的机会只有10-8-10-10。
3) 需要RNA引物起始DNA复制，DNApol只能从引物的3’ 端延伸DNA
碱基配对协同性使得最初几个碱基错配率高，而RNA引物最终被降解而避免错误。
4）后随链的不连续合成
因其有利于错配碱基的校正
1.3 其他生物的聚合酶

噬菌体也编码DNA聚合酶，它们是T4、T5、T7、SPIO1。这些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。

真核生物中发现了5种不同的DNA聚合酶，分别为α、β、γ、δ、ε。
前四个位于细胞核中，而γ是线粒体酶。
1.4 DNA聚合酶的引物(primer)
DNA复制为什么需要引物？
DNA聚合酶只能催化dNTP到已有核酸链的游离3’-OH上，而不能从游离核苷酸起始DNA链的合成。
DNA聚合酶需要引物来提供3’-OH末端，然后在其上加入核苷酸来延伸DNA链。
DNA复制需要合成引物
通常细胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通过DNA聚合酶延伸RNA链的3’-OH。
为什么需要一段RNA序列作为引物来进行DNA复制呢?
这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。
引物合成
1）大部分生物利用模板上合成一段RNA序列作为引物；
2）环状DNA在内部形成一个缺口产生引物末端，如滚环复制
3）直接引发合成，特殊蛋白质把核苷酸直接引入到聚合酶的催化位点。如腺病毒。
2 DNA连接酶（ DNA Ligase ）
1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶。
2.1 基本性质：能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。
1）E＋ATP→E－AMP＋ppi（动物细胞和噬菌体）
E＋NAD→E－AMP＋NMN（E.coli 等细菌）
2）E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化
3）活化的5’-PO4与相邻的3’-OH作用形成3’－5’
磷酸二酯键，并释放出AMP。
2.2 功能特点：
3 解旋酶 (helicase)
功能特点：
解旋酶可以促使DNA在复制叉处打开双链，解开氢键，形成单链。

利用ATP水解获得的能量来打断氢键
二聚体或六聚体形式存在
4 单链结合蛋白（SSBP）
功能特点：
在E.coli 中以四聚体存在
177个aa组成
74KDa
SSBP与螺旋酶不一样，不具备酶的活性，不和ATP结合。
SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。
在原核中SSBP与DNA结合表现出协同效应:
一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP结合到相邻的DNA上。
5 DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)

DNA复制在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。
5.1功能：
在DNA复制时，复制叉前方DNA分子部分产生正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。
DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。
5.2 类型
1）拓扑异构酶I (TopoⅠ)：
作用特点：
作用于单链DNA
不需要ATP和任何等辅助因子。
对环状单链、双链DNA有打结或解结作用，以及使环状单链DNA形成环状双链DNA。
2） 拓扑异构酶Ⅱ（ TopoⅡ ）：
也叫DNA旋转酶(DNA gyrase)
作用特点：
作用双链DNA，
需要ATP水解为ADP以供能量。
能够环连或解环连，以及打结或解结。
谢谢
再见！