DNA的生物合成
(复制)
DNA Biosynthesis，Replication
第 十 章
复制(replication)
是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。
复制的基本规律
Basic Rules of DNA Replication
第一节
复制的方式
——半保留复制(semi-conservative replication)

复制的高保真性(high fidelity)

双向复制(bidirectional replication)

半不连续复制(semi-discontinuous replication)
一、半保留复制的实验依据和意义
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。
半保留复制的概念
A
G
G
T
A
C
T
G
C
C
A
C
T
G
G
T
C
C
A
T
G
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G
G
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G
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G
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G
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G
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A
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T
G
G
T
C
C
A
T
G
A
C
G
G
T
G
A
C
C
+
母链DNA
复制过程中形成的复制叉
子代DNA
目 录
子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式 半保留式 混合式
密度梯度实验
——实验结果支持半保留复制的设想。
第一代
第二代
梯度离心结果
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。
半保留复制的意义
遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。
原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。
二、双向复制
A. 环状双链DNA及复制起始点
B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。
三、复制的半不连续性
领头链
(leading strand)
随从链
(lagging strand)
顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。
另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。
领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。
DNA复制的酶学
The Enzymology of DNA Replication
第二节
参与DNA复制的物质
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol
模板(template) : 解开成单链的DNA母链
引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合
其他的酶和蛋白质因子
一、复制的化学反应
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
目 录
聚合反应的特点
DNA 新链生成需引物和模板；
新链的延长只可沿5 → 3方向进行 。
二、DNA聚合酶
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)
简称：DNA-pol
活性：1. 53 的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
3  5外切酶活性
5  3外切酶活性
?
能切除突变的 DNA片段。
能辨认错配的碱基对，并将其水解。
核酸外切酶活性
目 录
（一）原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
DNA-pol Ⅲ
（一）原核生物的DNA聚合酶
功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。
DNA-pol Ⅰ
（109kD）
323个氨基酸
小片段
5  核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸
DNA聚合酶活性
  5 核酸外切酶活性
N 端
C 端
DNA-pol Ⅰ
Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。
DNA-pol Ⅱ（120kD）
DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
它参与DNA损伤的应急状态修复。
功能
是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
DNA-pol Ⅲ
(250kD)
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 
起始引发，有引物酶活性。
延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。
参与低保真度的复制 。
在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。
在线粒体DNA复制中起催化作用。
DNA-pol 
DNA-pol 
DNA-pol 
DNA-pol 
（二）真核生物的DNA聚合酶
三、复制保真性的酶学依据
复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。
复制保真性的酶学机制：
（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读
（二）复制的保真性和碱基选择
（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。
B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
（二）复制的保真性和碱基选择
• DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。
• 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。
1. 遵守严格的碱基配对规律；
2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；
3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。
（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白
E. Coli 基因图
目 录
解螺旋酶(helicase)
——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链
引物酶(primase)
——复制起始时催化生成RNA引物的酶
单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)
——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整
（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)
解链过程中正超螺旋的形成
目 录
拓扑异构酶作用特点
既能水解 、又能连接磷酸二酯键
拓扑异构酶Ⅰ
拓扑异构酶Ⅱ
分 类
拓扑异构酶Ⅰ
切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。
反应不需ATP。
拓扑异构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。
利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。
作用机制
目 录
五、DNA连接酶
连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。
DNA连接酶(DNA ligase)作用方式
HO
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶
ATP
ADP
5’
3’
5’
3’
目 录
DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。
在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。
也是基因工程的重要工具酶之一。
功能
DNA生物合成过程
The Process of DNA Replication
第三节
（一）复制的起始
需要解决两个问题：
1. DNA解开成单链，提供模板。
2. 合成引物，提供3-OH末端。
一、原核生物的DNA生物合成
E.coli复制起始点 oriC
1. DNA解链
Dna A
Dna B、 Dna C
DNA拓扑异构酶
引物酶
SSB
3
5
3
5
2. 引发体和引物
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。
3
5
3
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
引物
引物酶
（二）复制的延长
复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
OH 3'
3'
目 录
领头链的合成
目 录
随从链的合成
目 录
目 录
阶段一
阶段二
阶段三
阶段四
复制过程简图
目 录
复 制 过 程 动 画
原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。
（三）复制的终止
随从链上不连续性片段的连接
目 录
哺乳动物的细胞周期
DNA合成期
G1
G2
S
M
二、真核生物的DNA生物合成
• 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。
• 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。
• 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。
• 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。
• 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
（一）复制的起始
3
5
5
3
领头链
3
5
3
5
亲代DNA
随从链
引物
核小体
（二）复制的延长
染色体DNA呈线状，复制在末端停止。
复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。
染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。
（三）复制的终止
5
3
3
5
5
3
3
5
+
5
3
3
3
3
5
5
目 录
目 录
切除引物的两种机制
目 录
端粒酶(telomerase)
端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)
端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)
端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)
组成
端粒酶的催化延长作用
爬行模型
目 录
DNA聚合酶复制子链
进一步加工
目 录
逆转录和其他复制方式
Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways
第四节
逆转录酶(reverse transcriptase)
逆转录(reverse transcription)
一、逆转录病毒和逆转录酶
逆转录病毒细胞内的逆转录现象
分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。
以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。
试管内合成cDNA
cDNA complementary DNA
二、逆转录研究的意义
逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。
对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。
滚环复制(rolling circle replication)
三、滚环复制和D环复制
是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。
滚环复制
目 录
D环复制(D-loop replication)
是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。
DNA损伤（突变）与修复
DNA Damage (Mutation) and Repair
第五节
遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。
在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。
从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。
一、突变的意义
（一）突变是进化、分化的分子基础
（二）突变导致基因型改变
（三）突变导致死亡
（四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素
物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射
化学因素
目 录
三、突变的分子改变类型
错配 (mismatch)
缺失 (deletion)
插入 (insertion)
重排 (rearrangement)
DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。
（一）错配
镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基
正常成人Hb (HbA)β亚基
（二）缺失、插入和框移
缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。
插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。
框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
缺失或插入都可导致框移突变 。
缺失引起框移突变
（三）重排
DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。
由基因重排引起的两种地中海贫血基因型
目 录
四、DNA损伤的修复
修复(repairing)
是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。
光修复(light repairing)
切除修复(excision repairing)
重组修复(recombination repairing)
SOS修复
修复的主要类型
（一）光修复
光修复酶(photolyase)
UV
（二）切除修复
是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。
E.coli的切除修复机制
目 录
切 除 修 复 动 画
（三）重组修复
（四）SOS修复
当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。
在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。
这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。
附 录
E. Coli中的DNA聚合酶