细胞生物学
第一讲 细胞生物学概述 ——细胞生物学研究 的内容与现状
一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科
细胞生物学：是在显微、亚显微与分子水平等不同层次上研究细胞结构、功能及生命 活动规律的科学。
细胞生物学研究的对象是细胞。
细胞分子生物学是当前细胞生物学发展的主要方向。
细胞生物学研究的主要内容是 细胞的形态与结构、代谢与调控、增殖分化、遗传变异、衰老与死亡、起源与进化、兴奋与运动以及细胞的传递等。
二、细胞生物学的主要研究内容
大致可分为以下几 个方面：
(一)细胞核、染色体以及基因表达的研究
(二)生物膜与细胞器的研究
(三)细胞骨架体系的研究
(四)细胞增殖及其调控
（五)细胞分化及其调控
(六)细胞的衰 老与程序死亡
(七)细胞的起源进化
(八)细胞工程
三、当前细胞生物学研究的总体趋势与重点领域
（一）当前细胞生物学研究中的三大基本问题
1、细胞内的基因组是如何在时间与空间上有序表达的？
2、基因表达的产物如何逐级装配成基本结构体系及各种细胞器？
3、基因表达的产物如何调节细胞最重要的生命活动过程的？
（二）当前细胞基本生命活动研究的若干重大课题
1、染色体DNA与蛋白质相互作用关系——主要是非组蛋白对基因组的作用。
2、细胞增殖、分化、凋亡（程序性死亡）的相互关系及调控
3、细胞信号传导的研究
4、细胞结构体系的装配
一、细胞的发现
英国学者胡克于1665年制造了第一台有科研价值的显微镜，第一次描述了植物细胞的构造，细胞的发现是在1665年。1677—1683年，荷兰人列文胡克用自己设计好的显微镜第一次观察到活细胞。
二、细胞学说的建立及其意义
1、建立： 1838—1839年德国植物学家施莱登和动物学家施旺提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的 基本单位，这就是著名的“细胞学说”。
2、细胞学说的基本内容：①一切有机体都是由细胞发育而来的，并由细胞和细胞产物所构成；②每个细胞是一个相对独立的单位，执行特定的功能；③细胞只能通过细胞分裂而来。
第二讲 细胞概述
（一）细胞的概念：细胞是生命活动的基本单位
细胞是有膜包围的能进行独立繁殖的最小原生质团，简单地说细胞是生命活动的基本单位。可以从以下角度去理解：①细胞是构成有机体的基本单位；②细胞是 有 是代谢与功能的基本单位，有严格自动控制的代谢体系，并且有保证完成生命过程有序性的独立的结构装置。③有机体的生长发育是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。细胞是有机体生长发育的基础；④细胞具有遗传的全能性（除少数特化细胞），是遗传的基本单位。
（二）细胞的基本共性
细胞的基本共性有：①所有细胞都有细胞膜；②所有细胞都有DNA与RNA；③细胞都有核糖体；④细胞都以一分为二的方式分裂增殖。

三、 细胞
（三）细胞的种类
a、特点: ①无典型的细胞核，遗传物质仅由一个裸露的环状DNA构成； ②细胞内没有分化出以膜为基础的细胞器与细胞核膜。
1、种类繁多的细胞可以分为原核细胞、古核细胞与真核细胞。
2、原核细胞
b、种类：大约出现在35亿年前，包括支原体、衣原体、立克次体、细菌、放线菌及蓝藻(蓝细菌)等6类。
支原体：支原体是目前发现的最小、最简单的细胞，直径只有0.1~0.3µm,能在体外生长，也能寄生在细胞内。
细菌
（1）形态：球菌、杆菌、螺旋菌。
（2）核 区与基因：
一个环状的DNA分子盘绕在核区，没有或有极少的组蛋白，无明显的Feulgen（福尔根）反应。DNA复制不受细胞分裂周期的限制，可以连续进行，且DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译可以同时进行,这是细菌乃至整个原核细胞与真核细胞最显著的差异之一。
（3）细菌细胞的表面结构：
主要指细胞膜、细胞壁及其特化结构(中膜体、荚膜、鞭毛等)。细胞膜是细胞表面的重要结构。
细胞膜的功能包括：①选择性地物质运输；②细菌细胞膜有
丰富的酶系，执行重要的代谢功能。
中膜体由细胞膜内陷形成，可能起DNA复制的支点作用
细胞壁的共同成分是肽聚糖 ，革兰氏阳性菌与阴性菌细胞
壁成分与结构差异明显。
荚 膜是某些细菌表面的特殊结构，是位于细胞壁表面的
一层粘液物质。
鞭 毛是某些细菌的运动器官，结构简单
（4）细菌细胞的核糖体
核糖体的沉降系数为70S，由50S大亚单位和30S亚单位组成。大亚单位含有23S rRNA, 5S rRNA和30多种蛋白质，对红霉素与氯霉素敏感；小亚单位含有16S RNA与20多种蛋白质，对四环素与链霉素敏感。
（5）细菌细胞拟核外DNA
拟核外DNA：质粒。裸露的环状DNA，能自我复制，并可整合到核DNA中。
（6）细菌细胞的内生孢子
又称芽孢，是对不良环境有强抵抗力的休眠体。是细菌细胞内的重要物质(特别是DNA)，积聚在细胞的一端，形成致密体，可度过恶劣环境。
蓝藻
又称蓝细菌，是原核生物，又是最简单的自养植物类型之一。
蓝藻含有丰富的色素，可进行类似高等植物的光合作用。
其中央相当于细菌的核区；光合作用片层由藻胆蛋白构成，作用是将光能传递给叶绿素a；细胞质内含物有的是储存的养料，有的功能不详；细胞膜外有细胞壁和胶质层(鞘)。
c、原核细胞与真核细胞的比较
原核细胞与真核细胞的根本区别：①细胞膜系统的分化演变；②遗传信息量与遗传装置的扩增与复杂化。由于上述的根本差异，真核细胞的体积也相应扩增，细胞内部出现精密的网架结构——细胞骨架。
二者的区别可分为两部分进行比较：
①结构与功能比较：真核细胞的生物膜将细胞分化为核与质两部分，细胞质又分化出各种细胞器，细胞骨架又保证了细胞形态的合理排布与执行功能的有序性

②细胞遗传装置与基因表达方式的比较：核膜使扩增了的遗传信息与复杂的遗传装置相对独立 ，使基因表达的程序有严格的阶段性与区域性。
古细菌（又称原细菌）是一些生长在极端特殊环境中（高温或高盐）的细菌。最早发现的是产甲烷细菌类。
古核细胞的形态结构、遗传装置虽与原核细胞相似，但一些 基本分子生物学特点又与真核细胞接近。现已有更多的论据说明真核生物可能起源于古核生物，论据如下：
（1）古细菌的细胞壁成分与真核细胞一样；
（2）古核细胞DNA中有重复序列的存在；
（3）具有组蛋白；
（4）古核细胞的核糖体与真细菌的差异很大，从对抗生素的反应看，应更类似真核细胞的核糖体.
（5）根据对5SrRNA的分子进化分析和二级结构的研究，认为古细菌与真核生物同属一类。而真细菌却与之差别甚远。
3、古核细胞（古细菌）
4、真核细胞
1）、真核细胞的基本结构体系
①生物膜系统
细胞表面是一种多功能结构；核膜又把细胞分为细胞质与细胞核。
以生物膜系统为基础形成了各种细胞器。线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体及溶酶体等。
②遗传信息表达结构系统
由 DNA—蛋白质与 RNA—蛋白质复合体形成的遗传信息载体与表达系统，一般以颗粒或纤维状的基础结构存在。包括染色质，核 仁、核糖体等。
③细胞骨架系统
细胞骨架由特异的结构蛋白质构成网架系统，可分为胞质骨架与核骨架。
2）、细胞大小及其分析
细胞体积的守恒规律。
3）、细胞形态结构与功能的关系
细胞的形态与功能具有相关性与一致性。
4）、植物细胞与动物细胞的比较
植物细胞特有的细胞结构：细胞壁（主要成分是纤维素）、液泡、叶绿体等； 而动物细胞的中心粒在植物细胞中不常见到。
（1）病毒的基本知识
病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的生命体。类病毒仅由一个有感染性的RNA构成。朊病毒仅由有感染性的蛋白质构成。病毒是完整的寄生物。
根据核 酸类型不同，病毒 可分为DNA病毒与RNA病毒。依据宿主可分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒（噬菌体）等。
5、非细胞形态的生命体——病毒及其与细胞的关系
（2）病毒在细胞内的增殖（复制）
病毒的增殖又称病毒的复制，病毒的增殖必须在细胞内进行。
病毒在宿主细胞内分别复制病毒核酸与翻译病毒蛋白，然后将核酸与蛋白装配成病毒的基本结构。其复制过程大到可分为：
侵染，脱去衣壳，早基因的复制与表达，晚基因的复制、结构蛋白质的合成，装配、成熟与释放等过程。
（3）、病毒与细胞在起源和进化中的关系
病毒可能是细胞在特定条件下“扔出”的一个基因组，或者是具有复制与转录能力的mRNA。这些游离的基因组只有回到它们原来的细胞内环境中才能进行复制与转录。
第三讲 细胞生物学研究方法
一、光学显微镜技术
1、普通复式光学显微镜技术
普通光学显微镜（最大分辨率为0.2µm），主要由三部分组成：①光学放大系统，即目镜和物镜；②照 明系统；③机械和支架系统。
显微镜的性能优劣决定于它的分辨率d。分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。
λ为光源波长，α为物镜镜口角 。n物镜和标本之间介质的折射率。
在可见光中，亮度最大时ｄ近似为0.2μm。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2μm。也就是说，小于0.2μm的两物体，普通光学显微镜无法区分。
使用紫外线，可以减小照明光线的波长，能使分辨距离达到0.1μm。但因紫外线不能为人眼所见。只能拍成照片后再观察。
电子流的波长只有0.00387nm。利用“电子透镜”或磁透镜来控制电子流，所制成的电子显微镜的分辨距离达零点几nm。可以用它去观察原子的结构。
2、荧光显微镜技术
在紫外光显微镜基础上发展而来，利用样品自发荧光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和 定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。
3、激光共焦点扫描显微镜 技术
共焦点是 指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它 在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。
4、相差显微镜技术和微分干涉显微镜技术
光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜 的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差板。
微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。
录像增差显微镜技术在一定程度上可以填补光镜与电镜之间分辨率上的间隙。
二、电了显微镜技术
（一）电了显微镜基本知识
分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可达0.2nm，其放大倍数为106倍。
电镜的基本构造包括：①电子束照明系统 ；②电磁透镜成像系统；③真空系统；④记录系统；⑤电源系统。
（二）主要电镜制样技术介绍
样品制备技术的特殊要求：①样品要薄；②更好地保持样品的精细结构；③样品具有一定的反差。

主要的用于观察生物样品的电镜技术有：①超薄切片技术；是观察细胞超微结构的基础。②负染色技术；③冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术；④ 电镜三维重构技术；⑤扫描电镜技术（SEM）是观察细胞表面形的有力工具。
（三）扫描隧道显微镜(STM)
是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器，在纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。
STM的特点：①具有原子尺度的高分辨本领；②可在真空、大气、液体等条件下工作；③非破坏性测量。
三、离心技术——细胞组分的分析方法
细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。
（一）用差速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
（二）用平衡密度梯度离心技术分离精确分离
细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示(沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的沉降速率)。
原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。
福尔根(Feulgen)反应可特异显示DNA的存在部位。
PAS反应可确定多糖的存在。
四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 Ⅲ和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。
米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。
四、显色方法
——细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等测定
五、荧光技术——特异蛋白质抗原的定位与定性
免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。
1、荧光染色技术和免疫荧光技术
荧光染色技术是用荧光素（如核黄素、脂褐素）直接标记物质，在激发光的激发下，看到标记物所发荧光。
免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术 相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。
2、免疫电镜技术
免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究、胞内酶的研究、一些结构蛋白的研究。
六、原位杂交技术——细胞内特异核酸的定位与定性
用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。
七、放射自显影技术——研究生物大分子在细胞内的合成动态
放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射性标记物进行定性与定位测定。
放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。
基本步骤为：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、镜检。
第四讲 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
（一）动物细胞培养
从机体取出立即培养的细胞叫原代细胞（10代）。
将原代细胞分离、稀释接种到新的培养中继续培养的细胞为传代细胞。
从原代培养细胞中分离出来的可继续传代繁殖到40—50的细胞群体叫细胞株，细胞具有接触抑制的行为，有些具有贴壁生长的行为，具有正常的遗传物质。
从原代细胞或细胞株中获得的可无限传代的细胞叫细胞系。细胞无接触抑制行为，且具有遗传突变，带有癌细胞的特征。
一、细胞培养
细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞 或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。
（二）动物细胞融合技术即单克隆抗体技术
1975年英国学者Milestein等开创了将产生抗体的单个细胞同瘤细胞杂交的技术。他们的设计是经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞融合，融合的杂交瘤具有两种亲本细胞的特性即可分泌抗绵羊红细胞的抗体，又可无限增殖。学者们纷纷利用这 一技术来制备针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。
单克隆抗体就是单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体。
动物细胞融合技术即单克隆抗体技术
骨髓瘤细胞？
体外培养
从培养液中获取
抗原？
淋巴细胞？
体内培养
从腹水中提取
单克隆抗体
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞
细胞培养
（三）植物细胞培养
1、单倍体细胞培养：花药离体培养。（秋水仙素）
2、原生质体培养：去壁的植物细胞叫原生质体。可培养成植株或体细胞杂交植株。
植物组织培养
植物体细胞杂交
过程
离体的植物器官、组织或细胞
愈伤组织
根、芽
植物体
外植体
脱分化
植物激素：
细胞分裂素、生长素
再分化
植物组织培养
植物组织培养条件：
含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。
融合体
杂种细胞
去壁的常用方法：
原生质体融合方法：
植物体细胞杂交过程示意图
三、非细胞体系在细胞生物学研究中的作用
来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。

四、细胞工程
应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术 的领域为细胞工程。

细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。
（一）细胞融合与细胞杂交技术
真核生物的体细胞经过培养，两个或多个细胞融 合成一个双核或多核细胞的过程叫细胞融合。
动物细胞融合一般要用灭活的病毒(如仙台病毒)或 化学物质(如聚乙二醇，即PEG）介导；植物细胞事例时，要用纤维素酶去掉纤维素壁。
20世纪80年代又发明了电融合技术。
细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。
（二）细胞折合与显微操作技术
细胞拆合就是用物理方法（机械法和短波光）、化学法（用细胞松弛素）把细胞核与质分离开后将不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。
显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。