分子生物学
Molecular Biology
主要内容
1.基因的概念

2.基因表达及调控

3.组学的基本知识
广义：在分子水平理解生命现象的学科。
1. 生物化学：从化学角度解释生物分子（糖类、脂类、蛋白质、核酸及其他生物学分子）化学结构及其代谢途径的一门学科。从化学角度揭示生命现象的古老学科。
2.分子生物学：是在生物化学和经典遗传学基础上发展起来的一门新兴学科。以核酸（DNA和RNA）为研究对象，揭示基因的结构（染色体结构）、维持（ DNA复制、修复）和信息传递（转录和翻译）。
1.基因的概念
1857-1864年： 孟德尔经典遗传学规律：独立分配和自由组合规律。“遗传颗粒”—性状 。
1900年： 摩尔根 “遗传颗粒”定位在染色体上。
1909年： 丹麦科学家Johannsen “遗传颗粒” 命名为基因。
1944 年： 遗传物质为DNA。
1953年： DNA双螺旋结构的发现，分子生物学诞生。
1966年： 遗传密码子破译。
1972年： 基因工程的诞生及其后续的快速发展不但是分子生物学的结果而且大大促进了分子生物学的发展。
2000年 ：DNA 测序技术的发展获得模式生物和重要生物全基因组学列，分子生物学进入了后基因组和蛋白组时代，重点解决‘蛋白-RNA-DNA’互作的遗传语言问题。
孟德尔 摩尔根 Avery Watson and Crick 多利羊 HGP
基因的概念
基因是一段编码功能性RNA分子的DNA片段，包括传统意义上的编码蛋白质的基因，还包含一些非编码蛋白的基因，其终产物为RNA分子，如 tRNA、rRNA、 snRNA 和 miRNA。非编码蛋白的基因在编码蛋白质基因表达过程中具有重要作用的作用。
在基因的上下游会有调控DNA序列，如启动子和终止子序列， 控制着基因表达。
基因的结构模式图为：启动子-编码区-终止子
分子生物学研究的内容围绕着中心法则进行， 特别注意 RNA的重要作用和核心地位。
当前的中心法则
基因载体-染色质结构
DNA长度远远超过细胞核的直径，必需压缩折叠才能放入核中。压缩的层面有核小体-螺线管-突环，最终形成染色质。
大肠杆菌（E.coli）结构
E.coli染色体只含一个环状超螺旋分子，含量为4.6 Mb，完全展开后总长度大约1.3 mm.
细菌染色体
DNA双螺旋（2nm)

核小体（11nm）

螺线管（30nm)

突环(300nm)

染色体（1400 nm）
核小体及核小体核心颗粒
核小体：染色质在电子显微镜下观察时呈现为由10nm的球状 颗粒和DNA纤维组成的念珠状外观。这些球状颗粒称为核小体（nucleosome）。
核小体核心由组蛋白H2A, H2B, H3和 H4各两个亚基组成的八聚体，带正电荷，与带负电荷的DNA通过离子键结合。
核小体间的DNA称为接头DNA（linker DNA）。核小体所缔合的DNA约为166bp（146+20），由于连接DNA（约55 bp ）易于为核酸酶所作用。

因此，当染色质以微球菌核
酸酶（micrococcal nudease）等
轻微处理后，染色质就产生一系
列依次相差200 bp左右的长度不
等的DNA片段。
30nm纤丝
30nm纤丝：核小体链呈螺旋形缠绕，并形成超微螺旋，称为“螺线管”（solenoid），即30 nm纤丝。这种超微螺旋的直径约为3Onm，内径10nm，螺距为llnm，为中空呈管状结构。这种螺旋管的每一转由6个核小体组成，螺线管是染色体的二级结构。
突环结构
螺线管的纤丝沿着它中央的蛋白质轴发射出大小不等的环，像灯刷染色体那样，这些观察证明，染色体是由一系列的环状的域（domain）组成的。这种结构可以说是染色体的三级结构。
2. 基因表达及其调控
原核和真核细胞基因表达的区别
原核生物 真核生物
无细胞核 有细胞核
多顺反子（编码多种蛋白） 单顺反子（一般编码一种蛋白）
环状染色体 线性染色体
边转录边翻译 转录发生在细胞核，而翻译发生在细胞质
一般无内含子 一般有内含子

转录前水平：调控基因所在染色质的压缩程度，暴露出转录因子等结合位点，为基因转录创造条件。

转录水平：组成型表达，诱导型表达，细胞依赖性表达。

输出核孔：mRNA分子结合蛋白质介导加工成熟的mRNA出核，错误加工的mRNA分子则留在核中，被降解实现再循环利用。

细胞质中mRNA的存量调控：取决于转录产出量和降解量。
细胞质中mRNA的命运：有机会翻译蛋白质（细胞质核糖体，定位在内质网上的核糖体）、被降解（尤其错误加工的mRNA的分子），转移到其它细胞中翻译。

蛋白质翻译后水平：经过不同的折叠、化学修饰和剪接形成多种功能的蛋白质。是基因功能放大的一种有效措施。
现代观念：边转录边加工（加帽、去内含子、加尾），一步形成成熟的mRNA。
DNA复制
-----遗传物质保持和传代
DNA复制是多种酶（拓扑异构酶、解旋酶、DNA聚合酶、引发酶、 RNA酶、DNA连接酶）和辅助因子（增殖细胞核抗原PCNA，单链结合蛋白）协同作用以半保留半不连续的方式进行的。
DNA的半不连续复制
真核生物的复制子
真核生物的线形染色体是由多复制子构成，每个复制子都有自己的起点。一个典型的哺乳动物细胞有50 000～100 000个复制子，每个复制子长约40～200kbp。在相邻复制叉的复制泡相遇处，新生DNA融合并形成复制完整的DNA。
郭爱娟 BCU
参与DNA复制的有关物质
一、参与DNA复制的模板、底物和引物
二、参与DNA复制的有关酶和蛋白
1.DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase)
2.解旋酶(Helicase)
3.单链DNA结合蛋白(SSBP)
4.引发酶(Primase)
5.DNA聚合酶(DNA Polymerase)
6.DNA连接酶(DNA ligase )
酵母DNA复制所需要的酶
Schematic representation of the organization of eukaryotic DNA replication fork. ( yeast)
DNA复制过程中，随着复制叉的移动，核小体解聚，随后在新形成的子链中重新形成。
DNA转录
-----遗传信息流向RNA

转录单位包括启动子-转录区-终止子。转录因子识别启动子，招募RNA聚合酶以负链DNA为模板，按照A-U,G-C配对原则将游离的核苷酸按照5-3方向合成RNA分子的过程。
原核生物转录
原核生物转录和翻译是偶联的，其mRNA为编码多种蛋白的多顺反子。原核生物σ 因子协助RNA聚合酶识别启动子基本元件并由此起始转录 ，并在具有发卡结构的终止子处（或在ρ因子协助下）结束转录

操纵子是原核生物转录调控的主要模式，其中最典型的代表为乳糖操纵子。调控蛋白（或阻遏蛋白）与操纵区结合阻止RNA聚合酶前进达到降低转录效率。
转录单位
Figure 8.2
编码链/ +链
模板链/ -链
转录起始不需要引物。RNA聚合酶不具备识别启动子的能力，需要基本转录因子的协助。转录过程如下：起始-延伸-终止。
启动子（promoter）是能启动转录的一段DNA片段。常含有转录因子识别和结合的保守的和特异顺式元件（cis-elements），用以控制基因的转录起始。
特异转录因子结合元件 基本转录因子结合元件 转录起始位点
控制基因特异表达 招募RNA聚合酶组装转录起始复合物
(何时何地多少 ）
原核生物转录调控模型
3.在转录期间RNA聚合酶的结构和功能位点
（+）链 (β’ )
（-）链
Enzyme Movement
解旋 (α)
复旋 (α)
覆盖约40bp,其中约17 bp解链区
延伸
起始成功后，聚合酶释放出σ因子，形成核心酶-DNA-新生RNA链三元（三聚）复合物。随着转录泡的移动，不断地解螺旋和再螺旋（解螺旋区域的大小稳定地保持在17bp），RNA链不断的延长。
Figure 8.16
终止子
终止序列的特点：
1）发夹结构(减速)
2）4个或更多的U残基
（脱离）
依赖ρ的转录终止
不形成强的发夹结构，必须一种辅助因子即ρ蛋白来帮助转录终止。六聚体蛋白，识别72bp 序列（特异结构），依赖单链RNA水解ATP。
依赖ρ的转录终止
Rho factor (ρ)-dependent termination
操纵子与乳糖操纵子
1.提出：1961年, Jacob （雅格布）-Monod（莫诺）.
2.操纵子：操纵子是基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：结构基因、调控元件和阻遏蛋白编码基因。
大肠杆菌K12中共有4136个基因，以操纵子结构存在的基因接近1/4 （256 操纵子 控制879基因）
操纵子结构
结构基因：控制某一代谢途径关键酶的多顺反子。
调控元件：启动子 和操纵区（覆盖在启动子和编码区交叉区，是阻遏调节蛋白质的结合位点）。
调节基因：编码阻遏蛋白质独立的基因。
乳糖操纵子
启动区
调控元件
结构基因
β-半乳糖苷透性酶
分解乳糖
半乳糖和葡萄糖
运送乳糖透过细胞壁
乙酰辅酶A
乙酰半乳糖
调节基因
A
Y
Z
操纵区
分解X-gal
蓝色
乳糖阻抑物
PlacI
乳糖阻抑物四聚体
含回文结构（-5/+21）

异乳糖
安慰诱导物IPTG
真核细胞核基因的三种RNA聚合酶
核仁
pre-rRNA [28S 18S 5.8S]
不敏感
核质
pre-mRNA
small RNA
snRNA [U1,U2,U4,U5]
敏 感
核质
pre-tRNA
5SRNA
Small RNA
高浓度敏感
真核生物mRNA结构
真核生物基本转录机器的组装
II-F:与RNA pol 结合具有解旋复旋功能；II-H: 具有磷酸化CTD的功能；
TBP: TATA-BOX 结合蛋白质，识别启动子功能。
特异转录因子通过中介蛋白复合体间接地与基本转录机器互作改变转录起始频率。
染色质构象调控---转录前调控水平 表观遗传学
组蛋白乙酰化和脱乙酰化影响 染色质的紧密程度从而影响转录因子与启动子结合。
胞嘧啶与组蛋白的修饰
胞嘧啶
甲基化
转录后加工
-----从单一基因扩大编码mRNA分子种类
一基多能
基因复制-----转录后加工（可变剪接、可变启动子、可变加尾和RNA编辑）-----多种mRNA分子----多种蛋白质
真核基因转录后加工过程不但是形成成熟mRNA的必要过程（加帽、内含子剪接和加尾），同时也是重要的调控步骤。这一步骤使得单一的前体mRNA通过可变剪接、RNA编辑和可变加尾形成多种mRNA分子。此外，在同一个基因位点可以存在多个启动子和多个加尾位点，也可以驱动多种mRNA分子合成。综合这些加工手段（可变剪接、可变加尾、可变启动子和RNA编辑），最终从单一个基因产生多种mRNA分子，是遗传性信息扩大的重要手段。
一基多能
基因复制-----转录后加工（可变剪接、可变启动子、可变加尾和RNA编辑）-----多种mRNA分子----多种蛋白质
剪接基本元件（剪接位点和分支点）
5’..A A G U A A G U…..CURAY..(10-40).(U/C)N C A G G…3’
分支点序列
内含子剪接：位于内含子和外显子中的剪接元件识别并招募剪接机器，通过两次转酯反应完成除去内含子连接外显子，并护送出细胞核参与蛋白翻译过程。
mRNA剪接位点与SnRNA之间的相互识别
U1 snRNP结合在5端拼接点
U2 snRNP结合在分支点
需要SR蛋白正确引导
U4/U6和U5 snRNP三聚体进入拼接体， U6结合U2
剪接过程-顺序组装，动态的流水席
U1 、U4被释放
U6结合在5拼接点
U6/U2催化转酯反应
5位点断开，形成套索
3位点断开，外显子拼接
可变剪接方式
外显子跳跃
潜在的3-剪接位点利用
潜在的5-剪接位点利用
内含子滞留
内含子生物学功能
通过选择性剪接扩大转录本/蛋白种类。
具有调控基因表达（增强或减弱）的功能。
控制基因表达的组织器官特异表达。
充当启动子，产生新的转录本。
可变启动子
定义：选择不同的转录起始位点，可以获得具有不

同的5`序列的转录本。
功能：
#1 产生新的蛋白；
#2 增加新的N序列；
#3 引入具有复杂二级结构的5-UTR序列，减弱翻译。
可变加尾
选择不同的加尾位点，改变了3序列、空间结构以及结合蛋白。具有调控mRNA分子稳定性和基因表达的功能。
mRNA翻译
-----mRNA遗传信息流向蛋白质

1# 多种成分（氨基酸、核糖体、50种左右 t-RNA ，mRNA和多种蛋白因子）参与蛋白质合成。

2# 遗传信息的正确传递涉及到：20种以上的氨酰t-RNA合成酶将氨基正确加载到tRNA)-tRNA反密码子-mRNA密码子特异识别。

3#核糖体按照起始、延伸和终止程序合成蛋白。真核生物和原核生物蛋白合成主要区别在起始阶段。

4# 蛋白合成过程中或合成后需要修饰和折叠等加工过程，而加工的信号储藏在特定的氨基酸顺序（如导肽、信号肽）。

5#合成不正常或受损的蛋白主要通过泛素介导的蛋白酶复合体降解的途径，以实现氨基酸循环再利用。
遗传密码
连续性：从起始密码子到终止密码子按3的倍数连续读码。简并性：密码子的第三位碱基具有多态性。基本通用性：病毒、原核细胞和真核细胞。如：果蝇、酵母、和高等植物植物线粒体利用UGA作为色氨酸密码子。哺乳动物线粒体用AGA/G作为终止密码子，而核DNA则为精氨酸的密码子。
包含在mRNA三联核苷酸序列，它决定蛋白质中氨基酸的种类和排列顺序。
遗传密码（genetic code）
遗传密码的突变
错义突变（missense mutation）
密码子发生突变导致蛋白质中原来的氨基酸被另一种氨基酸取代。
无义突变（nonsense mutation）
氨基酸的密码子变成终止密码子。分为琥珀型（UAG）、赭石型（UAA）和乳白型（UGA）三种。
移码突变（frame shift mutation）
由于一个或多个非三整倍核苷酸对的插入或缺失，导致该位点后密码子阅读框架发生改变。
密码子和反密码子是反向配对
D loop
TC loop
Variable loop
Anticodon loop
三环一臂的二级结构
倒L三级结构
3 端-CCAOH上氨基酸接受位点（tRNA的荷载功能）
aa + tRNA
氨酰-tRNA
“第二遗传密码”------氨酰- tRNA合成酶对tRNA和氨基酸的再识别
核糖体只识别tRNA，而不能识别其携带的氨基酸。因此还存在氨酰- tRNA合成酶将正确的氨基酸加载到对应tRNA分子上，即氨酰- tRNA合成酶对tRNA和氨基酸的再识别。
核糖体
有很多双螺旋区
三、核糖体的功能位点
蛋白质合成过程
原核生物转录与翻译共线性
植物细胞生物具有三种不同蛋白和成体系：线粒体、叶绿体、细胞质， 它们在核糖体成分、tRNA等具有不同。
75%; ~20000 proteins
20%; 50~100 proteins
2~5%; proteins variable
翻译后加工
-----从单一蛋白质扩大功能的方式（ 不同折叠、修饰、亚基组装----多种功能）
翻译后的加工
移去部分氨基酸（信号肽、C或N）
折叠（共折叠和翻译后折叠）
降解（泛素介导的蛋白酶体降解）
修饰（磷酸化，糖基化，甲基化，乙酰化等）
Systemin(系统素), a peptide hormone, is formed by plant cells in response to wounding.
precursor 前体
系统素（18肽）
Molten globule
（溶球）
共翻译折叠
分子伴侣防止错误折叠
Hsp70 (70KD)
Hsp70结合新合成的肽链，维持可溶状态，然后送至折叠复合体中进一步折叠
Protein降解的生理意义
除去不正常（失去功能的、错误折叠、错误加工）的蛋白；
回收降解蛋白的氨基酸， 实现氨基酸的在循环利用。
维持聚合蛋白亚基的比例，防止亚基过量积累；
泛素分子结构
泛素 (Ubiquitin)
76aa
E1: ubiquitin- activating enzyme
E2: ubiquitin-conjugating enzyme
E3: ubiquitin-ligating enzyme
蛋白酶体
蛋白酶体结构
生物组学
-----分析细胞基因组DNA序列及其表达的所有mRNA和蛋白质种类及其相对数量的一门学科。它基于高通量（一次实验分析大量数据）的基因芯技术和2-D-MS技术(双向电泳偶联质谱)，并借助生物信息学分析手段获得细胞整体基因表达模式。
基因组学：单倍体细胞中所有DNA序列，可以揭示基因数量、分布、物种进化、分子标记等重要信息。多采用SHOT GUN全基因组测序技术。
转录组学：细胞中所有mRNA种类及其相对数量，具有特定的细胞类型、发育阶段和外界条件依赖性。多采用表达谱芯片技术。
蛋白质组学：细胞中所有蛋白质种类及其相对数量，具有特定的细胞类型、发育阶段和外界条件依赖性。多采用双向电泳技术。
蛋白质组学：细胞中所有蛋白质种类及其相对数量，具有特定的细胞类型、发育阶段和外界条件依赖性。多采用双向电泳技术。